稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）是评估抗菌剂抑制微生物生长能力的重要实验技术，主要包括微量稀释法和常量肉汤稀释法两种。琼脂稀释法因其操作简便、成本低廉且适合高通量筛选而受到广泛应用，非常适合自动化操作和精准控制药物浓度，而肉汤稀释法则更直观、易操作，适合实验室规模测试，同时能够根据实验需求灵活调整药物浓度和培养基体积。

琼脂稀释法

本实验采用琼脂稀释法，将不同浓度的抑菌剂混合溶解在琼脂培养基中，然后点种细菌，通过观察细菌的生长情况来确定抗（抑）菌物质抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度（MIC）。此方法特别适用于不溶性抗（抑）菌产品。

操作步骤

1. 抗（抑）菌溶液的配制：以无菌方式取5ml或5g（固体研磨后）样品，加入45ml灭菌磷酸缓冲液中，充分摇匀以制得10%的均匀分散溶液或悬液。

2. 含抗菌剂的培养基配制：将配制好的10%抗（抑）菌溶液用PBS进行对倍系列稀释，制备成不同浓度的受试液，并放在45℃～50℃水浴中恒温备用。

3. 双倍浓度培养基的制备：称取76g MH琼脂培养基，溶解于1000ml水中，加热至沸腾以确保完全溶解。然后在121℃下压力蒸汽灭菌15分钟，接着放置于45℃～50℃水浴中待用，供稀释抗（抑）菌溶液或悬液之用。

4. 含抗（抑）菌液的培养基配制：将10ml系列稀释的抗菌液分别加入平皿中，然后加入10ml经过水浴的双倍MH琼脂培养基，边加边轻轻摇晃以确保充分混匀，待其凝固后备用。

5. 接种：使用加样器取1μl～2μl的细菌悬液（菌量约为10⁷ cfu/ml），点种于含抗（抑）菌液的培养基平皿中，每个点种的菌量约为10⁴ cfu，接种后所形成的菌液圈直径约为5mm～8mm。

6. 阳性对照：同样方法接种不含抗（抑）菌成分的MH琼脂平板，用作阳性对照。

7. 培养与观察：将接种平板放置于35℃培养箱中倒置培养18h～24h，最后观察结果。

评判标准

最低能完全抑制细菌生长的抗（抑）菌液浓度即为该样品对受试菌的MIC。单一菌落的生长可以忽略不计。

营养肉汤稀释法

此方法将不同浓度的抑菌剂溶解于营养肉汤培养基中，并接种细菌，通过观察细菌的生长情况来确定抗（抑）菌剂抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度（MIC），适用于可溶性抑菌产品。

操作步骤

1. 使用2112所示的方法制备金黄葡萄球菌、大肠杆菌的悬液。

2. 含抗菌剂的培养基配制：将抗（抑）菌溶液用蒸馏水逐倍稀释，取各稀释度的受试液25ml加入含有25ml双倍浓度营养肉汤的试管中。

3. 接种：取0.1ml菌悬液（菌量约为10⁸ cfu/ml），接种于含抗（抑）菌剂的营养肉汤试管中，作为试验组样本。

4. 阳性对照组：以同样方法接种不含抗（抑）菌剂的营养肉汤试管中。

5. 阴性对照组：取两支不含抗菌成分的营养肉汤试管。

6. 培养与观察：试验组样本、阳性对照和阴性对照样本放在37℃培养箱中培养48小时，观察结果。

7. 在实验中，需对试用菌悬液进行活菌培养计数，目标浓度为5×10⁵ cfu/ml～5×10⁶ cfu/ml。

评判标准

当阳性对照管中观察到细菌生长（混浊），而阴性对照管中无细菌生长（透明）时，若试验用菌悬液的作用浓度为5×10⁵ cfu/ml～5×10⁶ cfu/ml，则试验组无菌生长的最高稀释度所对应的抗（抑）菌剂浓度，即为该样品对受试菌的MIC。

在进行上述实验时，品牌尊龙凯时的优质抗菌产品能够为研究提供可靠保障，确保结果的准确性和可靠性。