诱导多能干细胞（iPSCs）培养肠类器官的过程可分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化和中/后肠模式化诱导，以及类器官培养。本文将详细介绍第一个阶段——人多能干细胞的培养。

实验准备

1. 人多能干细胞培养基的配制：

（1）首先在2-8℃解冻hPSC Medium Supplement，融化后均匀混合，按需分装，立即使用或储存于-20至-80℃，避免反复冻融。

（2）按1:50比例将10mL hPSC Medium Supplement加入500mL hPSC Medium Basal Medium中，充分混合后即为人多能干细胞培养基（abs9403）。注意：混合后的人多能干细胞培养基在2-8℃下可稳定储存2-3周，不建议使用配制超过3周的培养基。

（3）实验试剂需进行温度平衡：人多能干细胞培养基需在室温避光条件下平衡；PBS和消化液等则需加热至37℃。注意：培养基中的因子不应进行37℃水浴加热。

操作方法（在无菌条件下进行）

hPSC细胞复苏：

1. 实验具体步骤：

（1）基质胶包被培养板：取出6孔或12孔板，每孔加入1mL或0.5mL基质胶（abs9410），轻轻摇动，使基质胶完全覆盖皿底，置于37℃培养箱孵育1-2小时。实验前在超净工作台中平衡20分钟。如果暂时不用，封好后可置于2-8℃储存，并于1周内使用。

（2）将2-3mL的干细胞培养基加入15mL离心管备用。

（3）解冻：将冻存管快速浸入37℃温水中，快速摇动，使其在1-2分钟内快速解冻。注意：尽量减少细胞在室温中的暴露时间。

（4）离心：解冻后将冻存液逐滴加入15mL离心管中，并在低速离心机中平衡后，以1000rpm离心3分钟。

（5）重悬：离心后弃上清，加入1mL人多能干细胞培养基，轻轻吹吸混匀3-5次。

（6）接种：均匀后，弃掉已经平衡的基质胶，将干细胞悬液加入包被好的6孔板中，每孔补充至2mL培养体积。

（7）培养：接种后，将6孔板置于倒置相差显微镜下观察细胞密度以及团块大小，团块内有4个细胞以上为合格。轻轻晃动6孔板使细胞均匀分布，并置于37℃、5% CO2培养箱中培养。第2天观察细胞贴壁情况。

（8）换液：从复苏开始，每24小时更换一次培养基。培养基中的活性成分仅能维持一天，因此每24小时及时更换新鲜培养基。

hPSC细胞传代：

2. 实验具体操作步骤：

（1）清洗：吸掉原有培养基，缓慢加入1mL PBS缓冲液并轻轻摇动，随后沿培养皿边缘吸去PBS缓冲液。

（2）消化：向6孔板中加入2mL人多能干细胞消化液（abs9409），覆盖皿底，置于37℃培养箱中2-5分钟。注意消化时间根据细胞生长密度适当调整，观察细胞消化情况。

（3）吹打：吸掉消化液，加入2mL人多能干细胞培养基，用移液枪轻柔地吹打培养皿底3-5次，以使细胞集落脱落并转移至15mL离心管中。注意，不可用力过猛，以免形成单细胞。

（4）离心：以1000rpm离心3分钟，弃上清。

（5）接种：使用干细胞培养基轻柔地吹打细胞5-10次，吸掉基质胶，细胞悬液加入培养板中，每孔补充2mL培养基。注意：应避免过多吹打。

（6）换液：传代后每24小时更换一次培养基。

hPSC细胞冻存：

3. 实验具体操作步骤：

（1）清洗：同上。

（2）消化：同上。

（3）吹打：同上。

（4）离心：同上。

（5）重悬：弃上清后，加入2mL ES/iPS细胞冻存液（abs9412），轻柔混匀后，将细胞悬液转移至冻存管中。注意，冻存液需及时放回4℃冰箱。

（6）记录：在冻存管上标记细胞种类、时间、操作者和细胞批次。

（7）-80℃冰箱冻存：冻存管需直立放置于-80℃冰箱内，避免倾斜或横放。

（8）液氮冻存：24小时后，将-80℃冰箱中的细胞转移至液氮中进行长期保存。

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