尊龙凯时细胞培养指南

一、细胞培养条件

细胞名称：生长特性：贴壁生长
冻存条件：无血清冻存液
培养体系：1640 + 10% FBS + 1% P/S + 1% 丙酮酸钠 + 1% L-谷氨酰胺
传代方法：首次建议1:2传代，传代情况需在2天后更换培养基。如对比培养效果不佳，建议直接购买尊龙凯时的完全培养基。

二、细胞接收后处理

收到细胞后，应将其培养至良好状态，随后加入完全培养液并封好瓶口，这是运输细胞的最佳方法。使用75%酒精对整个细胞瓶进行消毒，随后转移至超净台内进行无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态，然后进行处理。观察细胞生长情况，并拍摄不同倍数的照片（建议40x, 100x, 200x各一张）。前三天的照片将作为售后依据，不提供照片将默认为收到状态良好。在传代后，建议使用一瓶原瓶的完全培养基和一瓶自制的完全培养基进行对比培养，并在换液后将瓶盖稍微拧松。

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

若未超过80%汇合度，则将培养瓶中的完全培养液收集至离心管中，留5ml完全培养基放入37℃、5% CO2孵箱中培养。若细胞密度超过80%，即可进行传代培养，具体步骤如下：
1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS清洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，在37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞状态；若细胞变圆且逐渐脱落，迅速移回操作台，轻敲培养瓶后添加至少5ml完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出，并将悬液转移至离心管中，在1000 RPM下离心5分钟，弃去上清液，重悬于1-2ml完全培养基中。
4. 按1:2的比例将细胞悬液分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放置于37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。

b. 细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖T25培养瓶80%时，弃去培养液并用PBS清洗一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶，观察细胞回缩变圆后，加入5ml完全培养液以终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃上清，沉淀细胞后加入1ml尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱中，若后期要转入液氮罐中，应在-80℃冰箱存放24小时以上再转入液氮罐。

四、细胞复苏

从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护装备），迅速置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶。随后用75%的酒精擦拭冻存管外壁，将细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。弃上清后用5ml完全培养基重悬，然后接种至T25培养瓶，放置于37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。第二天更换为新鲜的完全培养基继续培养。

五、售后条款

1) 出现细胞问题时，何种情况可重发？判定标准如下：
- 运输途中遭遇问题（如细胞丢失、瓶身破损、培养液泄漏等）可重发；
- 若48小时内报告细胞污染情况并提供真实实验结果，经核实后可重发；
- 常温发货细胞在静置24小时后或干冰冻存细胞复苏后24小时大多数未存活（需提供真实清晰细胞状态照片）可重发；
- 细胞活性问题在收到7天内提供真实实验结果（使用台盼蓝染色法鉴定）可重发；
- 收到细胞当天及第2、3天内需拍照，超出3天默认为合格；
- 若4-7天内出现问题时，需提供前3天照片、问题时照片及操作步骤，技术人员可判定责任，若判定为我方责任则重发，若责任需协商处理即可收取50%的重发费用。

2) 在以下情况下不予重发：
- 客户造成的细胞污染，由客户自行承担；
- 客户不当操作导致细胞状态不佳，不予重发；
- 非本库推荐的细胞培养体系导致的细胞状态不佳，不予重发；
- 未提供细胞培养前三天的照片亦不予重发；
- 若细胞在培养过程中经其他处理，则不予重发；
- 在收到细胞后2天内未告知情况则不予重发；
- 具体情况需视究。